Обычные и стереоскопические микроскопы позволяют вести исследования по методу светлого поля : на светлом фоне наблюдается изображение контрастного неокрашенного или цветного объекта. Данный метод применяется наиболее широко.

Метод тёмного поля основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света (применяют специальный конденсор). При этом контрастный светлый объект виден на тёмном фоне.

Метод фазового контраста предназначен для повышения контрастности неокрашенных объектов (микроорганизмов, растительных клеток). Данный метод, в отличие от метода тёмного поля (выявляет только контуры), позволяет рассматривать элементы внутренней структуры объекта, детально изучать особенности срезов тканей или живых клеток.

Метод исследования в поляризованном свете применяется для изучения анизотропных клеточных структур, которым характерна строгая молекулярная ориентация. К таковым относятся, например, внутриклеточные мембраны, нити веретена деления, миофибриллы, мерцательные реснички. В поле зрения поляризационного микроскопа они выглядят ярко светящимися на тёмном фоне.

Метод интерференционной микроскопии основан на разделении светового пучка на два: один проходит через объект, второй - мимо него. В результате первый пучок несколько запаздывает и при интерференции (наложение друг на друга) изменяется яркость световой волны. Вследствие резко выраженной разности оптических путей неокрашенный объект может выглядеть цветным.

Метод исследования в свете люминесценции проводится с помощью микроскопа, на котором установлены особый осветитель, люминесцентные объективы и система специальных светофильтров. Этот метод основан на явлении, возникающем, когда при облучении некоторые вещества и микрообъекты сами начинают светиться в цветовой гамме всего (или большей части) видимого спектра (рис. 4).

Данный метод нашёл широкое применение при цитохимических исследованиях, позволяющих изучать поступление, передвижение, накопление и выделение различных веществ клетки. В медицинской микробиологии его применяют для выявления возбудителей туберкулеза, дифтерии, гонореи, возвратного тифа и др.; в онкологии - для цитодиагностики опухолей.

Электронная микроскопия

Первый электронный микроскоп сконструировал в 1934 г. немецкий учёный Э. Руска. Электронная микроскопия применяется с 1939 г. Это один из важнейших методов исследования структуры объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм).

Современные электронные микроскопы дают возможность получить изображения объектов при увеличениях, приближающихся к 1 000 000.

В электронной микроскопии построение изображения основывается на законах геометрической и волновой оптики, а также на теории электромагнитных полей. В данном случае «линзами» служат электромагнитные катушки. Магнитное поле, создаваемое витками катушки, по которой проходит ток, фокусирует пучок электронов так же, как стеклянная линза собирает световой пучок.

По принципу действия современные электронные микроскопы разделяются на просвечивающие и растровые (сканирующие). Первые позволяют изучать образцы в проходящих, а вторые - в рассеянных объектом электронах.

Устройство и принцип действия просвечивающего электронного микроскопа подобны таковым светового микроскопа: аналогом источника света является электронный прожектор (электронная пушка); имеются объективная и конденсорные «линзы»; камера с предметным столиком; проекционная система, которая соответствует окуляру, но передает изображение на люминесцентный экран или фотографическую пластинку. Такой аппарат весит несколько тонн и достигает в высоту 2,5–3 м (рис. 5).

Источником электронов служит раскаленная вольфрамовая нить (катод). Излучаемые электроны ускоряются сильным электрическим полем и, проходя через отверстие в аноде, собираются в узкий пучок. Система «катод–анод» называется электронным прожектором.

Исследуемый образец находится в магнитном поле объективной линзы - самой важной линзы, которая в итоге определяет максимальное разрешение микроскопа. Эта линза направляет прошедший через образец поток электронов в систему проекционных линз, а последние - на люминесцентный экран или фотографическую пластинку.

В результате бомбардировки электронами фотопластинки или экрана, покрытого специальным флуоресцирующим составом, получаетсявидимое увеличенное изображение.

При столкновении с веществом электроны в той или иной степени меняют траекторию движения. Электронный поток рассеивается даже воздухом, поэтому в колонне работающего электронного микроскопа поддерживается глубокий вакуум, а исследуемый объект должен иметь минимальную толщину.

Участки препарата с повышенной плотностью или увеличенной толщиной, местá расположения тяжёлых атомов сильно отклоняют электроны, и потому выглядят тёмными зонами на светлом фоне (метод светлого поля).

Однако электромагнитные поля можно отрегулировать так, чтобы в диафрагму объектива попадали только рассеянные электроны. Тогда образец выглядит светлым на тёмном фоне (метод тёмного поля).

Изображение можно наблюдать через присоединенный к прибору бинокулярный световой микроскоп, выводить на телевизионный экран или записывать на видеоленту. Если регистрация электронов производится на фотографической пластинке, то получают снимок объекта - электронограмму (рис. 6). Электронограммы можно ещё увеличить примерно в 10 раз без потери чёткости.

Рис. 6. Электронограммы: А - митохондрия (метод светлого поля), Б - участок кристы митохондрии (метод тёмного поля)

Электронный микроскоп сканирующего типа изобретён в 50-х годах ХХ века. Его магнитные линзы фокусируют испускаемые электроны в пучок очень маленького диаметра (всего несколько десятков нанометров), называемый электронным зòндом . Последний перемещается по объекту подобно лучу, обегающему экран радиолокатора, и за определённое время сканирует заданную площадь поверхности образца. В результате на экране возникает рельефное изображение сканируемой поверхности объекта. Такой режим работы микроскопа позволяет получать высококачественные объёмные электронограммы (рис. 7).

Основным недостатком электронной микроскопии является тот факт, что она не позволяет наблюдать живые объекты, поскольку исследуемый материал помещается в условия вакуума и подвергается радиационному повреждению (электронный поток представляет собой ионизирующее излучение).

Применение электронной микроскопии в биологии и медицине направлено на исследования таких объектов, которые невозможно обнаружить с помощью обычного светового микроскопа. Путём электронной микроскопии выявлены детали строения биологических мембран, митохондрий, эндоплазматической сети, рибосом и других органоидов клетки. Данный метод широко применяется для изучения тонкого строения про- и эукариотических клеток, вирусов, бактериофагов, прочих субмикроскопических объектов.

В области медико-биологических исследований современные электронные микроскопы позволяют получить изображение даже отдельных макромолекул биополимеров (нуклеиновых кислот, белков, полисахаридов). Тем самым они вносят огромный вклад в развитие современной медицины, дают возможность глубже вникнуть в сложную биологическую сущность человека.

Конфокальный микроскоп и изображения, сделанные с его помощью: растрескивание пыльника, сосуды ксилемы, хлоропласты в клетках рыльца.

Световая микроскопия
Световой микроскоп, главный прибор биологии, представляет собой оптическую систему, состоящую из конденсатора, объектива. Пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект (рис. 1). Пройдя через объект, лучи света попадают в систему линз объектива; они строят первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, - объектив. В современных микроскопах объективы сменные, что позволяет изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность. Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например, путем проекции на экран (до 105 раз). Вычислено, что разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно, будет равно

где? - длина волны света, используемого для освещения объекта; n – коэффициент преломления среды; ? - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив. Разрешение микроскопа зависит от длины волны – чем она меньше, тем меньшего размера деталь мы можем увидеть, и от нумерической апертуры объектива (n sin ?) – чем она выше, тем выше разрешение. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать ультрафиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13-0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света. Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, - это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую
способность около 0,1 мм, что равно 100 мкм). Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа.
Но все же в световом микроскопе можно видеть частицы меньшей величины, чем 0,2 мкм. Это метод «темного поля», или, как его называли раньше, метод «ультрамикроскопии». Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света (эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.
Если же необработанные живые или мертвые клетки рассматривать в проходящем свете, то в них различаются только крупные детали из-за того, что они обладают иным коэффициентом преломления и поглощения световых лучей, чем окружающая среда. Большая
же часть клеточных компонентов мало отличается по этим свойствам как от среды (воды или тканевых растворов), так и друг от друга и поэтому мало заметны и не контрастны. Для их изучения приходится изменять освещенность (теряя при этом в четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Один из таких приемов – метод фазово-контрастной микроскопии, широко использующийся для наблюдений за живыми клетками. Он основан на том, что отдельные участки прозрачной в общем клетки хоть мало, но все же отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как он чувствителен только к изменению интенсивности света. Последняя зависит от величины амплитуды световой волны. В фазово-контрастном микроскопе в объектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся
в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.
Сходный прием используется в интерференционном микроскопе. Он устроен так, что пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект и приобретает изменения в фазе колебания, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. В этом приборе, измеряя сдвиги фаз, можно определить концентрацию и массу сухого вещества в объекте.
С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающие так называемой изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (например, волокна веретена деления, миофибриллы и др.). У такого микроскопа перед конденсором
помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Поляризатор и анализатор – это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя). Если вторую призму (анализатор) повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.
Витальное (прижизненное) изучение клеток
Световой микроскоп позволяет видеть живые клетки. Для кратковременного наблюдения клетки помещают просто в жидкую среду на предметное стекло; если нужно длительное наблюдение за клетками, то
используются специальные камеры. Это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же разборные плоские камеры. В качестве объектов можно использовать свободноживущие клетки простейших и других одноклеточных организмов, клетки крови или же разобщенные тканевые клетки многоклеточных организмов как животного, так и растительного происхождения. В любом из этих случаев клетки изучают в специально подобранных средах. Свободноживущие одноклеточные организмы рассматривают и изучают в тех же средах, в которых они живут в естественных условиях или культивируются в лаборатории. Так, для некоторых простейших созданы искусственные среды, на которых они растут и размножаются. Обычно это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов или других простейших, служащих пищей для данного вида организма.
Клетки крови или другие свободные клетки многоклеточных могут изучаться в капле плазмы или в специальных синтетических средах.
Для изучения клеток органов и тканей животных используют
метод клеточных культур. Более простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную питательной средой (смесь плазмы крови с эмбриональным экстрактом или смесь синтетической среды с добавлением плазмы крови), помещают небольшой кусочек живой ткани. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток. В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина или хелатона - версена, что приводит к его диссоциации, к полному разобщению клеток друг от друга. Затем такую взвесь отмытых клеток помещают в сосуд с питательной средой, где они опускаются на дно, прикрепляются к стеклу и начинают размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт. Так растут однослойные клеточные культуры, очень удобные для прижизненных наблюдений. Лучше всего для получения первичных культур из тканей животных использовать эмбриональный материал; культуры из клеток взрослых организмов растут очень плохо.

При культивировании клеток вне организма кроме смены среды важно поддерживать и необходимую температуру (около 20о для хладнокровных и около 37о для теплокровных). Обязательным условием культивирования клеток является соблюдение стерильности. Существует целый ряд длительно культивируемых клеток; это специальные клеточные штаммы, приспособившиеся десятилетиями к росту вне организма. Большей частью это клетки опухолевого происхождения или значительно измененные клетки, приобретшие свойства опухолевых клеток.
Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и для генетических, вирусологических и биохимических исследований.
В культуре можно выращивать и растительные клетки. Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду, где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток.
Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде
фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроскопу. Живые клетки можно снимать и на кинопленку. В ряде случаев такая микрокиносъемка дает очень важную информацию. Применяя ускоренную или замедленную киносъемку (цейтраферная киносъемка), можно подробно видеть протекание таких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, биение ресничек и т.д.
Теперь с развитием компьютерных технологий с помощью специальных телекамер возможно получать изображение клеток прямо на мониторе компьютера, записывать их в памяти компьютера, всячески обрабатывать и получать отпечатки на принтерах цветных или черно-белых. Так же возможно использовать такую компьютерную видеотехнику для цейтраферной съемки подвижных объектов.
При исследовании живых клеток используют методы микрохирургии, оперативного воздействия на клетки. С помощью прибора микроманипулятора клетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества (микроинъекция) и т.д. Микроманипулятор совмещается с обычным
микроскопом, в который наблюдают за ходом операции. Микрохирургическими инструментами служат стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые имеют микроскопические размеры и изготовляются на специальных приспособлениях – «микрокузницах». При микроманипуляциях клетки помещают в специальные камеры, в которые вводят также инструменты. Так, с помощью микроманипулятора удалось пересадить ядра от одного штамма амебы другому и доказать, что именно клеточное ядро определяет физиологические особенности клетки в целом. С помощью микроманипулятора удалось инъецировать в клетку амебы коллоидное золото, а затем исследовать распределение его частиц в цитоплазме и ядре.
С помощью таких микрохирургических инструментов можно поворачивать в клетках митотические веретена, оттаскивать отдельные хромосомы, вводить в живую клетку меченые антитела или разные белковые молекулы. Кроме механического воздействия на клетки в микрохирургии в последнее время широко применяют микропучки ультрафиолетового
света или лазерные микропучки. Это дает возможность практически моментально инактивировать отдельные участки живой клетки. Так, например, можно инактивировать одно из ядрышек и следить за судьбой второго, интактного. В этом случае показано, что второе ядрышко принимает на себя дополнительную нагрузку и «работает за двоих». С помощью микропучков удается поразить часть митотической хромосомы или участок веретена деления. Оказалось, что поражение центромеры хромосомы выводит последнюю из процесса расхождения хромосом к полюсам клетки во время митоза. Недавно стали применять аппараты с лазерным микролучом, что позволяет очень точно дозировать количество энергии в точке поражения и использовать очень короткие (наносекунды) импульсы облучения.
При изучении живых клеток пытаются их окрашивать с помощью так называемых витальных красителей. Это красители кислой (трипановый синий, литиевый кармин) природы, применяемые при очень большом разведении (1: 200000), следовательно,
влияние красителя на жизнедеятельность клетки минимальное. При окрашивании живых клеток краситель собирается в цитоплазме в виде гранул, а в поврежденных или мертвых клетках происходит диффузное окрашивание цитоплазмы и ядра.
При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующие красители и метод флуоресцентной микроскопии. Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладает способностью светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Так, например, выделенный хлорофилл при освещении в ультрафиолетовых лучах светится красным цветом. Этот принцип используется в флуоресцентной микроскопии: рассматривание флуоресцирующих объектов в зоне коротких длин волн. Обычно в таких микроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области. Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы.

Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы, бактериальные пигменты), витамины (А и В2), гормоны. Если во флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синем фоне будут видны ярко светящиеся красные зерна внутри клетки – это хлоропласты.
Можно применять метод флуоресцентной микроскопии, добавляя живым клеткам флуорохромы (флуоресцирующие вещества). Этот способ сходен с витальным окрашиванием в том смысле, что здесь также используют очень низкие концентрации красителя (1 х 10-4–1 х 10-5). Многие флуорохромы избирательно связываются с определенными структурами клетки, вызывая их вторичную люминесценцию. Так, например, флуорохром акридиновый оранжевый избирательно связывается с нуклеиновыми кислотами. Причем, связываясь в мономерной форме с ДНК, он флуоресцирует зеленым цветом, а в димерной форме с РНК светится красным цветом. Наблюдая за живыми клетками, окрашенными акридиновым оранжевым, видно, что их ядра имеют зеленый цвет свечения, а цитоплазма
и ядрышки святятся красным цветом. Тем самым в живой клетке с помощью этого метода можно видеть локализацию (а в некоторых случаях рассчитывать количество) тех или иных химических веществ. Существуют флуорохромы, избирательно связывающиеся с липидами, слизью, кератином и др.
В живые клетки можно инъецировать также меченые флуорохромами антитела. Так, например, введенные в клетку связанные с флуорохромом антитела к белку тубулину соединяются с микротрубочками, которые теперь можно наблюдать в живых клетках с помощью флуоресцентного микроскопа.
В последнее время начинает широко использоваться для изучения живых клеток или их компонентов сочетание световой микроскопии (особенно фазовоконтрастной) с электроннно-компьютерной обработкой изображения. При этом используется видеозапись с электронной обработкой изображения, которая как бы «убирает» фоновые уровни и выделяет, контрастирует наблюдаемые структуры. Такая методика позволяет на телеэкране видеть такие структуры
как микротрубочки, размер которых (20 нм) намного меньше разрешающей силы светового микроскопа. Применение таких систем не только заменяют цейтраферную киносъемку, вместо которой используется видео-запись, но и позволяет компьютерную обработку изображения: сведения о плотности структур, о их параметрах, числе и трехмерной организации. В сочетании с флуоресцентной микроскопией эти методы открывают огромные перспективы в изучении живых клеток.
Обычные методы световой микроскопии трудно использовать для воспроизведения трехмерной картины изучаемого объекта из-за небольшой глубины резкости микроскопа. Обычно клетки рассматриваются как оптические разрезы на данной глубине фокуса. Для того, чтобы получить полную трехмерную реконструкцию объекта используют специальный конфокальный сканирующий световой микроскоп. С помощью этого прибора получают серии последовательных оптических срезов, взятых с различной глубины и изображения которых накапливаются в компьютере, и по специальной
программе реконструируется трехмерное, объемное, изображение объекта. Обычно используются объекты, окрашенные флуорохромами.
Изучение фиксированных клеток
Несмотря на важность и достаточную простоту витальных наблюдений, большая часть сведений о структуре и свойствах клеток получена на фиксированном материале. Если клетку повредить, она начинает претерпевать ряд изменений, а после смерти клетки в ней активируются автолитические ферменты, что приводит к грубым изменениям клеточной структуры. Следовательно, задачи фиксации – это убить клетку, прекратить активность внутриклеточных ферментов, предотвратить распад клеточных компонентов, а также избежать потери структур и веществ, препятствовать появлению структур, отсутствующих в живой клетке (артефактные структуры). К сожалению, еще не найден такой химический фиксатор, который бы удовлетворял всем этим требованиям.
Часто для фиксации используются альдегиды и их смеси с другими веществами. В качестве фиксаторов применяют также спирты,
вызывающие необратимую денатурацию белков, осаждение нуклеиновых кислот и полисахаридов. Осаждающим действием обладают такие сулемовые фиксаторы и фиксаторы с пикриновой кислотой. Фиксаторы, содержащие четырехокись осмия (OsO4), хорошо сохраняют липиды.
После фиксации объекты в дальнейшем можно подвергать дополнительной обработке. Одной из главных таких обработок является окрашивание клеток. Именно дополнительное окрашивание клеток позволило выявить в них массу деталей.
Стекла с фиксированными мазками одноклеточных организмов или с клетками культуры ткани можно непосредственно помещать в красители. Но для окрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Изучают такие срезы и отдельных клеток.
Для этого после фиксации кусочки органов обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, спирт замещают ксилолом, а ксилол – парафином. Таким образом, фиксированная ткань, минуя высушивание на воздухе, оказывается заключенной в твердую массу парафина, которую можно нарезать.

Срезы толщиной до 5-10 мкм получают на специальном приборе – микротоме. Такие срезы приклеиваются на предметное стекло: парафин растворяется в ксилоле, ксилол удаляется спиртами, которые замещаются водой. Теперь срезы можно окрашивать водными растворами красителей. Для изготовления постоянных препаратов окрашенные срезы снова обезвоживаются и заливаются в канадский бальзам под покровным стеклом, эти препараты можно длительно хранить.
Для окраски фиксированных тканей и клеток применяют различные натуральные и главным образом синтетические красители. Натуральные красители (гематоксилин, кармин и др.) употребляют в сочетании с протравами (окислы различных металлов), с которыми они образуют комплексные соединения (лаки).
Синтетические красители подразделяют на кислые и основные. Основные краски представляют собой соли красящих оснований, содержащие в своем составе аминогруппы, которые и определяют их щелочность. Такие красители образуют солевые связи с
кислотными группами в структурах клетки. Следовательно, участки клеток, богатые кислотными группами, свяжутся с основными красителями, будут, как их называют, базофильными. Кислотные красители содержат в своем составе гидроксильные группы, или группы SO2OH. Структуры клеток с основными (щелочными) свойствами связываются с кислотными красителями и называются ацидо- или оксифильными. Существует множество смесей таких красителей, которые одновременно могут окрашивать различные участки клеток в разные цвета и тем самым повышать контрастность клеточных и внеклеточных компонентов. Таким образом, используя всевозможные красители, исследователи не только добиваются четкости морфологической картины клетки, но получают некоторые сведения о химизме той или иной структуры.
Ряд красочных приемов, направленных на выявление специфических химических веществ, получил название гистохимических и цитохимических. Методов цитохимического анализа очень много.
Существует целый ряд специфических красочных приемов, прямо
выявляющих те или иные вещества. Это собственно гистохимические (цитохимические) реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества.
Примером такого рода цитохимических реакций может быть широко применяемая реакция на ДНК, реакция Фёльгена (рис. 8). Суть ее в том, что после специфического кислотного гидролиза только на ДНК в результате отщепления пуринов на дезоксирибозе образуются альдегидные группы. Эти группы могут взаимодействовать со специфическим индикатором, реактивом Шиффа (обесцвеченное основание фуксина), давая красное окрашивание в местах локализации ДНК. Связывание красителя в этом случае строго количественное, что позволяет не только обнаружить и указать места, где есть ДНК, но и измерить ее количество. Используя этот же принцип выявления альдегидных групп, можно в клетках видеть расположение полисахаридов после гидролиза их периодной кислотой (так называемая PAS-реакция).

Также специфически можно определить локализацию белков реакциями на отдельные аминокислоты (тирозин, триптофан, аргинин и др.). Липиды и жиры обнаруживают в клетках специальными красителями (судан черный), хорошо растворяющимися и аккумулирующимися в жировых включениях.
Целая группа цитохимических реакций связана с обнаружением ферментов. Общий принцип этих реакций в том, что в микроскоп видны не сами белковые ферменты, а места их локализации, которые обнаруживаются по продуктам их специфической ферментативной активности.
Количество конечного продукта цитохимической реакции можно определить с помощью метода цитофотометрии. Основу его составляет определение количества химических веществ по поглощению ими света определенной длины волны. Было найдено, что интенсивность поглощения лучей пропорциональна концентрации вещества при одной и той же толщине объекта. Следовательно, оценивая степень поглощения света данным веществом, можно узнать его количество. Для такого рода исследований используют
приборы – микроскопы-цитофотометры; у них за объективом расположен чувствительный фотометр, регистрирующий интенсивность прошедшего через объект светового потока. Зная площадь или объем измеряемой структуры и значение поглощения, можно определить как концентрацию данного вещества, так и его абсолютное содержание. Широко используется метод цитофотометрии при определении количества ДНК на клетку после реакции Фёльгена. В данном случае фотометрируется не сама ДНК, а содержание красно окрашенного фуксина, количество которого прчямо пропорционально содержанию ДНК. Сравнивая полученные величины поглощения со стандартами, можно получить точные значения количества ДНК, выраженные в граммах. Этот метод позволяет измерять количество ДНК до 10-12 – 10-14 г, в то время как микрохимические методы имеют чувствительность не более 10-6 г. С помощью цитофотометрии содержание ДНК в клетках определяется намного точнее обычных биохимических методов.
Количественную оценку получают не только поглощающие свет
объекты и вещества, но и излучающие (светящиеся). Так, разработаны приемы количественной флурометрии, позволяющие по степени свечения определить содержание веществ, с которыми связываются флуорохромы.
Для выявления специфически белков применяют иммунохимические реакции с использованием флуоресцирующих антител. Этот метод иммунофлуоресценции обладает очень большой специфичностью и чувствительностью. Его можно использовать для выявления не только белков, но и отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или для определения мест локализации РНК-ДНК гибридных молекул. Для этого сначала на белок (например, тубулин) получают специфические сыворотки, содержащие антитела. Очищенные антитела химически соединяют с флуорохромами. Такие препараты наливают на объекты и с помощью люминесцентного микроскопа по свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Однако для того, чтобы меченные флуорохромами антитела проникли в клетку, необходимо плазматическую мембрану
сделать проницаемой. Обычно это достигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран. Для изучения с помощью этого метода цитоскелетных белков прибегают к растворению клеточных мембран различными детергентами.
Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения путей переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отельных клеток широко используют метод радиоавтографии – регистрации веществ, меченных изотопами (рис. 9). Принцип этого метода очень прост, он повторяет метод Беккереля, открывшего радиоактивный распад. При радиоавтографическом исследовании клеткам в среду вводится предшественник одного из макромолекулярных соединений (например, аминокислота или нуклеотид), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом. Например, вместо 12С введен атом 14С, вместо водорода – тритий 3Н и др. В процессе синтеза в биополимер включится и меченая молекула предшественника. Регистрировать ее место
в клетке можно с помощью фотоэмульсии. Если клетки в пласте или на срезе покрыть фотоэмульсией, то через некоторое время в результате распада изотопа – частицы, разлетающиеся хаотично в разных направлениях, попадут в зону чувствительного фотослоя и активируют в нем зерна бромистого серебра. Чем больше будет время экспозиции, т.е. контакта такой меченой клетки с фотоэмульсией, тем больше зерен AgBr будет засвечено. После экспозиции надо проявить препарат, при этом происходит восстановление серебра только в засвеченных гранулах, при фиксации препарата незасвеченные гранулы AgBr растворяются. В результате из массы гранул, которые покрывали объект, останутся только те, которые были активированы?-излучением. Просматривая в микроскоп такие препараты, поверх которых нанесен слой фотоэмульсии, исследователь находит места локализации зерен серебра, которые располагаются напротив мест, где содержится меченое вещество (рис. 9).
Этот метод имеет ограничения: точность его будет зависеть
от величины зерна AgBr и от энергии частицы. Чем больше величина зерна, тем с меньшей точностью можно узнать место расположения изотопа. И чем выше энергия частицы и длиннее ее пробег, тем дальше от места распада будет происходить активация зерен AgBr . Поэтому для метода радиоавтографии используют особые мелкозернистые фотоэмульсии (0,2-0,3 мкм) и изотопы с малой энергией?-частиц, главным образом изотоп водорода, тритий (3Н). Тритием могут быть мечены любые предшественники биологических макромолекул: нуклеотиды, аминокислоты, сахара, жирные кислоты. Используются также для радиоавтографических исследованных меченые гормоны, антибиотики, ингибиторы и др. Радиоавтографически нельзя изучать растворимые в воде соединения, так как в процессе обработки клеток водными растворами (фиксация, проявление и т.д.) они могут потеряться. Другим ограничением метода является достаточно высокая концентрация данных веществ, так как при низкой концентрации радиоактивного вещества время экспозиции увеличивается, при этом растет
опасность появления фона засвеченных гранул AgBr за счет космического излучения.
Метод радиоавтографии – один из основных методов, позволяющих изучать динамику синтетических процессов, сравнить их интенсивность в разных клетках на одном и том же препарате. Так, например, с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.
Метод радиоавтографии используется также для определения расположения определенных типов нуклеиновых кислот или отдельных нуклеотидных последовательностей в составе клеточных ядер или хромосом – метод молекулярной гибридизации. Для этого раствор с меченной нуклеиновой кислотой (например с рибосомной РНК) или с ее фрагментом (например, с сателитной ДНК) наносят на препарат, предварительно обработанный так, чтобы денатурировать ДНК (разорвать водородные связи в нативной ДНК) в составе
хромосом или ядер, что достигается щелочной или температурной обработкой образца,. В процессе ренатурации ДНК происходит образование молекулярного гибрида между меченой нуклеиновой кислотой из раствора и комплементарным ему участком ДНК в препарате. Место такой гибридизации определяется радиоавтографически. Этот метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот позволяет с большой точностью локализовать на хромосоме места с данной нуклеотидной последовательностью или даже расположение определенных генов.
Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот используется также при окраске их флуорохромами. Например, если выделенную ядрышковую ДНК, ответственную за синтез рибосомных РНК, предварительно связать с каким-либо флуорохромом, то после проведения ренатурации ДНК на препаратах с этой флуоресциирующей рибосомной ДНК, можно видеть, что флуоресценция будет наблюдаться только в ядрышках интерфазных клеток или только в зонах ядрышковых организаторов митотических хромосом. Таким образом
можно в клетках локализовать любые последовательности ДНК и даже расположение в ядрах отдельных хромосом. Этот прием называется FISH-метод (флуоресцентная in situ гибридизация).
Электронная микроскопия
Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 1 А (0,1 нм). По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо
сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку (рис. 7).
Основная часть такого микроскопа представляет собой полый цилиндр (колонка микроскопа), из которого откачан воздух для того, чтобы не было взаимодействия электронов с молекулами газов и окисления вольфрамовой нити накаливания в катоде электронной пушки. Между катодом и анодом подается высокое напряжение (от 50 до 200-5000 кВ), что служит причиной ускорения электронов. В центре анода есть отверстие, проходя через которое электроны формируют пучок, идущий вниз по колонке микроскопа. Линзы электронного микроскопа представляют собой электромагниты, поле которых может изменять путь электронов (как стеклянные линзы изменяют путь фотонов). В конденсорной линзе пучок электронов фиксируется и попадает на объект, с которым электроны взаимодействуют, отклоняются, рассеиваются, поглощаются или проходят без изменения. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной линзой, которая формирует
увеличенное первичное изображение объекта. Так же как в световом микроскопе, объективная линза определяет его основные показатели. Первичное изображение увеличивается проекционной линзой и проецируется на экран, покрытый люминесцентным слоем, светящимся при попадании на него электронов. Вместо светящегося экрана изображение можно поместить на фотопластинку и получить снимок.
Напряжение, которое используется для ускорения электронов в большинстве просвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов, достигает 50-150 кВ. При напряжении в 50 кВ электрон обладает длиной волны в 0,05 А, и в этом случае теоретически можно было бы получить разрешение в 0,025 А (d ~ 0,5 ?). Однако в современных конструкциях электронных микроскопов достигается разрешение около 1 А из-за недостаточной стабильности напряжения, стабильности тока линз, неоднородности металла магнитных линз и других несовершенств прибора (теоретически возможно еще повысить разрешение электронного микроскопа
в 100 раз). Но и достигнутое разрешение огромно (вспомним, что величина О-Н связи в молекуле воды равна 0,99 А): оно сейчас уже в 106 раз выше разрешающей способности глаза!
На экранах и фотопластинках электронных микроскопов можно получить увеличение до 50 000 раз, в дальнейшем при фотопечати можно получить еще 10-кратное увеличение, так что конечное увеличение, при котором максимально реализуется разрешение, может достигать 106 раз (например, если 1 мм увеличить в 106 раз, то он достигнет длины в 1 км).
В настоящее время электронно-микроскопическое изображение с флуоресцирующего экрана с помощью цифровой телекамеры передается прямо в компьютер, где на экране монитора его можно обрабатывать различным образом (изменять увеличение, контрастность изображения, применять денситометрию, плани- и морфометрию отдельных компонентов). Используя принтер можно получить отпечатки полученных изображений.
Максимальное разрешение электронного микроскопа (ЭМ) реализуется
сейчас только при исследовании металлов или кристаллических решеток. На биологических объектах такого разрешения получить пока не удается из-за низкой контрастности объекта. Биологические объекты для исследования в ЭМ помещаются на медные сеточки, покрытые тонкими пленками – подложками (формвар, коллодий, углерод), состоящими в основном из углерода. Биологические объекты также в основном содержат углерод и, следовательно, мало по плотности будут отличаться от фона, будут мало контрастны. Показано, что минимальная толщина биологического объекта с плотностью около 1 г/см3, выявляемого при ускоряющем напряжении в электронном микроскопе 50 кВ, равна 50 А. Вирусы, расположенные на поддерживающей пленке, будут видны в этом случае в виде бесструктурных пятен, а молекулы нуклеиновых кислот (толщина ДНК равна 20 А) вообще не видны из-за низкого контраста. Контраст биологических объектов можно повысить, используя тяжелые металлы или их соли.
Контрастирование корпускулярных объектов

Корпускулярными объектами можно назвать частички вирусов, фагов, выделенные клеточные компоненты (рибосомы, мембраны, вакуоли и т.д.), макромолекулы.
Одним из широко распространенных методов контрастирования биологических объектов является оттенение металлами. В этом случае в специальных вакуумных установках производится термическое испарение металла. При этом атомы металла разлетаются от места испарения по прямым траекториям. Встречаясь с объектом, они осаждаются на нем в виде слоя; его толщина будет больше в местах, перпендикулярных направлению полета частиц металла. В участках, где объект экранирует пучок частиц, возникнут «тени». Таким образом, напыленная часть объекта обладает большей плотностью, чем напыленная подложка (фон), и поэтому объект будет виден. Этот метод широко применяется не только для контрастирования вирусов, рибосом, но и для достаточно тонких молекул нуклеиновых кислот. Минус этого метода в том, что он приводит к увеличению размеров объекта на толщину
напыленного слоя, который в лучшем случае достигает 10-15 А. Другой недостаток его в том, что он дает информацию только о внешнем виде и объеме частиц. Для контрастирования оттенением используется платина, палладий, их сплавы, уран.
При негативном контрастировании объектов растворами солей тяжелых металлов применяют молибденовокислый аммоний, уранилацетат, фосфорно-вольфрамовую кислоту (ФВК) (рис. 10). Если водные растворы таких веществ смешать с биологическими объектами, а затем их нанести на пленки-подложки и высушить, то объекты (например, вирусы или белковые комплексы) окажутся как бы погруженными в тонкий слой аморфного вещества высокой плотности. В электронном микроскопе они выглядят как светлые объекты на темном фоне (как фотонегатив). Преимущества метода в том, что растворенные соли могут проникать в глубь объекта и выявлять дополнительные его детали. Негативное контрастирование широко применяется при изучении вирусов, ферментных комплексов мембран. Нитчатые молекулы нуклеиновых кислот этим методом
выявляются плохо из-за их малой толщины.
Соли тяжелых металлов можно использовать при так называемом позитивном контрастировании. В этом случае контрастирующее вещество связывается со структурой, повышает ее электронную плотность. Часто для позитивного контрастирования нуклеиновых кислот используют растворы уранилацетата в спирте или в ацетоне. Уранилацетат, контрастируя нуклеиновые кислоты, хорошо прокрашивает центральные полости сферических вирусов, значительно повышает контраст рибосом и позволяет видеть тонкие нити выделенных нуклеиновых кислот.
Ультрамикротомия
При изучении объектов в электронном микроскопе возникает еще одно осложнение – это их толщина. Дело в том, что при прохождении пучка электронов через объект часть электронов поглощается, что приводит к нагреванию объекта и к его деформации. Поэтому необходимо иметь тонкие объекты (не выше 0,1 мкм). Другое ограничение заключается в том, что даже если мы будем рассматривать неизменяющиеся объекты большой толщины (около
0,5-1 мкм), что в принципе возможно (например, в мегавольтном электронном микроскопе, см. ниже), то на конечном изображении будут наслаиваться проекции структур, располагающихся на разных уровнях по толщине объекта. Тем самым изучать в трансмиссионных микроскопах внутреннее строение целых клеток плохо и неудобно. Выход из этого положения аналогичен тому, что было найдено для световой микроскопии, - делать срезы очень малой толщины, ультратонкие срезы (0,05-0,10 мкм).
Процедура их изготовления в принципе сходна стой, что используется в световой микроскопии. Клетки и ткани для этого сначала фиксируют. В качестве фиксаторов используются буферные растворы глутарового альдегида или четырехокиси осмия. Наиболее часто применяется двойная фиксация: сначала глутаровый альдегид, а затем осмий, который как тяжелый металл контрастирует клеточные структуры. Затем, после обезвоживания, ткани пропитываются эпоксидными смолами или другими пластиками в жидкой, мономерной
форме. При полимеризации таких пластмасс пропитанный ими объект оказывается заключенным в твердые блоки, которые уже можно резать на тонкие срезы. Здесь возникают две проблемы: где взять идеальные ножи, изъяны которых не сказывались бы при изучении клеток на почти молекулярных уровнях, и как изготовить срезы толщиной в сотые доли микрона. Первая задача была решена таким образом: оказалось, что идеально острой и без зазубрин режущей поверхностью обладают сколы стекла (рис. 11). Но стеклянные ножи очень недолговечны, их используют только один раз. Применяют алмазные ножи: это специальным образом заточенные мелкие алмазы, они служат в течение нескольких лет.
Проблема изготовления сверхтонкого среза была решена тоже, казалось бы, просто – это термическая подача объекта. Блок с заключенным в пластмассу объектом крепится на металлическом стержне, который нагревается и тем самым продвигает объект вперед на определенную величину за известное время. И если эту термическую подачу согласовать с ритмическими циклами
резания, то можно получить серии срезов заданной толщины. Это достигается при использовании специальных приборов – ультрамикротомов. Существуют конструкции ультрамикротомов, где подача объекта осуществляется механически.
Площадь получаемых ультратонких срезов обычно очень мала (0,1-1 мм2), поэтому все операции при ультрамикротомировании идут под микроскопическим контролем. Срезы, смонтированные на сетках с подложкой, необходимо дополнительно контрастировать – «окрашивать» с помощью солей тяжелых металлов. В этом случае используют также соли свинца и урана, которые связываясь с внутриклеточными структурами на срезе, позитивно их контрастируют.
Техника изготовления ультратонких срезов открыла огромные возможности для применения электронной микроскопии буквально во всех областях биологии и медицины
Этот метод позволяет применять цитохимические приемы на уровне электронной микроскопии: в данном случае необходимо, чтобы продукты реакции были электронноплотными, отклоняли
бы электроны. Кроме того, реакции не должны приводить к появлению артефактных картин уже на ультраструктурном уровне. Число цитохимических методов в электронной микроскопии пока не велико, но это направление интенсивно разрабатывается.
В электронно-микроскопических исследованиях оказалось возможным применить методы радиоавтографии. В этом случае используются сверхтонкозернистые эмульсии (величина гранул около 0,02-0,06 мкм). Недостатком этого метода является очень большое время экспозиции, в некоторых случаях достигающие нескольких месяцев.
Все большее применение получают методы приготовления ультратонких срезов без фиксации и заливки клеток в твердые пластмассы. Это методы криоультрамикротомии, т.е. получение срезов с замороженных тканей, моментально охлажденных до температуры жидкого азота (-196оС). При этом происходит практически одномоментное торможение всех метаболических процессов, а вода из жидкой фазы переходит в твердую, но не кристаллическую,
ее молекулярная структура беспорядочна (стекловидное состояние). Такие твердые блоки при температуре жидкого азота можно резать на ультратонкие срезы (нож при этом также охлажден). Полученные срезы используют для выявления в них активности ферментов, для проведения на них иммунохимических реакций, для ферментативного переваривания и т.п.
Для проведения иммунохимических исследований используют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализация которого на препаратах и указывает на места расположения искомого антигена.
Изучение срезов, полученных на криоультратомах, показало, что общая структура и композиция клеточных компонентов в данном случае мало отличаются от того, что видно при использовании химической фиксации и обычных приемов получения ультратонких срезов. Следовательно, те структуры, которые имеют одинаковую композицию при разных методах обработки материала, по-видимому, близки к своему прижизненному строению, не являются артефактными.

В пользу этого говорят данные по исследованию клеток с помощью иных приемов электронной микроскопии.
Для изучения структуры различных мембранных компонентов клетки используется метод замораживания–скалывания. Он заключается в том, что объект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при той же температуре переносят в специальную вакуумную установку. Там замороженный объект механическим способом скалывается охлажденным ножом. При этом обнажаются внутренние зоны замороженных клеток В вакууме часть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), а поверхность скола последовательно покрывается тонким слоем испаренного углерода, а затем металла. Таким образом с замороженного и сохраняющего прижизненную структуру материала получают реплику с его скола (рис. 12). Затем уже в условиях комнатной температуры ткань или клетки растворяют в кислотах, но пленка-реплика при этом остается цела, ее изучают в электронном микроскопе. Этот метод имеет два преимущества: изучают реплики со сколов
нативных образцов; исследуют рельеф поверхности мембран клетки, что недостижимо другими методами. Оказалось, что и в этом случае общая организация клетки и ее компонентов сходна с тем, что мы видим при химической фиксации или при криотомии. Этот метод позволил увидеть, что как на поверхности, так и в толщине клеточных мембран располагаются глобулы интегральных белков, что мембраны не однородны по своей структуре.
Метод получения реплик с микрорельефа образца широко применяется при изучении фибриллярных компонентов клетки. Так при изучении цитоскелета клеток культуры ткани или форменных элементов крови клетки обрабатывают детергентами для того, чтобы растворить все мембраны. Это приводит к тому, что из клетки вымываются все компоненты, кроме фибриллярных белковых компонентов цитоскелета и материалы ядра. Такие препараты затем фиксируются, обезвоживаются и специальным образом сушатся. Вслед за этим сухие препараты напыляются углеродом и контрастируются распылением
тяжелых металлов, после чего такая реплика снимается со стекла, на котором росли клетки, и просматривается в трансмиссионном электронном микроскопе.
Другие специальные методы электронной микроскопии биологических объектов
В последнее время начинают применять методы высоковольтной (вернее, сверхвысоковольтной) микроскопии. Сконструированы приборы с ускоряющим напряжением 1-3 млн. вольт. Это очень дорогие приборы, что сдерживает их широкое применение. Преимущество этого класса электронных микроскопов не в том, что на них можно получить более высокое разрешение (при более короткой длине волны электронов), а в том, что при высокой энергии электронов, которые меньше поглощаются объектом, можно просматривать образцы большой толщины (1-10 мкм). Дополнительное использование стереоскопической съемки позволяет получить информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким их разрешением (около 0,5 нм).
Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии позволяет
изучать трехмерную картину поверхности клетки. При сканирующей электронной микроскопии тонкий пучок электронов (зонд) пробегает по поверхности объекта и полученная информация передается на электронно-лучевую трубку. Изображение может быть получено в отраженных или вторичных электронах. При этом методе фиксированный и специальным образом высушенный объект покрывается тонким слоем испаренного металла (чаще всего золота), отражаясь от которого электроны попадают в приемное устройство, передающее сигнал на электронно-лучевую трубку. Благодаря огромной глубине фокуса сканирующего микроскопа, которая значительно больше, чем у просвечивающего, получается почти трехмерное изображение исследуемой поверхности. Разрешающая способность этого типа приборов несколько ниже, чем у просвечивающих электронных микроскопов, но уже сейчас выпускаются приборы с разрешением 3-5 нм (рис. 13).
С помощью растровой электронной микроскопии можно получить информацию о химическом составе в тех или иных участках
клеток. Так, метод рентгеноспектрального микроанализа основан на идентификации и количественной оценке содержания химических элементов по спектрам характеристического рентгеновского излучения, возникающего при взаимодействии первичных электронов с атомами объекта. Для получения такой информации, конечно, объекты не следует покрывать слоем металла, как при обычном методе сканирующей электронной микроскопии. Более того, объект нужно подготовить так, чтобы не было потери или дополнительного внесения элементов. Для этого используют быстро замороженные и высушенные в вакууме объекты.
Фракционирование клеток
В цитологии широко применяют различные методы биохимии, как аналитические, так и препаративные. В последнем случае можно получить в виде отдельных фракций разнообразные компоненты и изучать их химический состав, ультраструктуру и свойства. Так, в настоящее время в виде чистых фракций получают практически любые клеточные органеллы и структуры: ядра, ядрышки, хроматин,
ядерные оболочки, плазматическую мембрану, вакуоли эндоплазматического ретикулума, его рибосомы, рибосомы гиалоплазмы, аппарат Гольджи, митохондрии, их мембраны, пластиды, пероксисомы, микротрубочки и т.д., и т.п. В последнее время получены чистые фракции центриолей и ядерных пор.
Получение клеточных фракций начинается с общего разрушения клетки, с ее гомогенизации. Затем из гомогенатов уже можно выделять фракции. Одним из основных способов выделения клеточных структур является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения в том, что время для осаждения частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Чтобы ускорить этот процесс оседания, используют ускорения, создаваемые центрифугой. При центрифугировании раньше всего и при небольших (1-3 тыс. g)ускорениях осядут ядра и неразрушенные клетки, при 15-30 тыс. g осядут крупные частицы, макросомы, состоящие из митохондрий, мелких пластид,
пероксисом, лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты вакуолярной системы клетки. При повторном дробном центрифугировании этих смешанных подфракций можно получить чистые фракции. Так, при разделении макросомной подфракции получают отдельно митохондрии, лизосомы, пероксисомы. При разделении микросом можно получить фракцию мембран аппарата Гольджи, фрагментов плазматической мембраны, вакуолей, гранулярного ретикулума. В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе.
Полученные фракции, прежде чем их анализировать биохимическими способами, необходимо проверить на чистоту с помощью электронного микроскопа.
Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность изучать их биохимию и функциональные особенности. Так можно создать бесклеточную систему для рибосом, которые будут
синтезировать белок по заданной экспериментатором информационной РНК, выделенные митохондрии в подобранных условиях могут осуществлять синтез АТФ, на выделенном хроматине при участии соответствующих ферментов может происходить синтез РНК и т.д.
В последнее время применяются бесклеточные системы для воссоздания клеточных надмолекулярных структур. Так, используя очищенные от гранул желтки, экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яиц морских ежей, можно получить ядра с ядерной оболочкой из введенной в эту бесклеточную систему чужеродной ДНК (например ДНК бактериофага). Такая ДНК связывается с белками-гистонами, которые есть в избытке в таком экстракте, образуется хроматин (дезоксирибонуклеопротеид), который покрывается двойной мембранной оболочкой, несущей даже ядерные поры. Такие модельные системы помогают изучать тонкие, интимные процессы, например транспорт макромолекул из цитоплазмы в ядро и наоборот. В цитоплазматических экстрактах яиц земноводных и иглокожих
такие ядра могут периодически делиться путем митоза. Эти модели внесли огромный вклад в расшифровку природы регуляции клеточного цикла.
Большой вклад в биологию клетки вносят методы клеточной инженерии. Было найдено, что различные живые клетки могут сливаться друг с другом, если специальными способами обработать их плазматические мембраны. Так можно слить эритроцит курицы и лимфоцит человека. При этом получается двуядерная клетка, гетерокарион, в котором происходит активация ядра куриного эритроцита (рис.14). Если гетерокарион образуется из близкородственных клеток (например, мыши и хомячки), то при вступлении их в митоз хромосомы могут объединиться в одну метафазную пластинку. После разделения такой клетки получится истинно гибридная клетка. Другие приемы позволяют конструировать клетки из разных по происхождению ядер и цитоплазмы (рис. 15). Так, разрушив актиновый компонент цитоскелета и подвергнув клетки центрифугированию можно клетку разделить на две части: ядро
с узким ободком цитоплазмы – кариопласт и на оставшуюся часть цитоплазмы – цитопласт. Затем используя разные кариопласты и цитопласты, можно создавать разные комбинации реконструированных клеток.
Методы клеточной инженерии широко применяются не только в экспериментальной биологии, но и в биотехнологических целях. Например, при получении моноклональных антител используются клеточные гибриды между лимфоцитами иммунизированных животных и интенсивно размножающимися клетками миеломы. Полученные первичные дикарионы образуют истинные гибридные клетки, которые интенсивно размножаются за счет генома опухолевых миеломных клеток, и одновременно выделяют большое количество антител, за счет работы генома иммунизированных лимфоцитов. Этот прием позволяет получать большое число гибридомных клеток, вырабатывающих большие количества необходимых антител.
Нет необходимости приводить описание всех методов и приемов, используемых в цитологии для изучения строения, химии и
функций клеток или их компонентов. Этого краткого обзора достаточно для того, чтобы показать богатство арсенала методов в цитологии, позволяющих давать точный анализ, начиная от формы, общего вида и размера клетки, кончая молекулярной композицией ее отдельных частей.

К концу XIX в. большая часть структур, которые удается разглядеть с помощью светового микроскопа (т. е. микроскопа, в котором для освещения объекта используется видимый свет) была уже открыта. Клетка представлялась тогда чем-то вроде маленького комочка живой протоплазмы, всегда окруженного плазматической мембраной, а иногда - как, например, у растений и неживой клеточной стенкой. Самой заметной структурой в клетке было ядро, содержащее легко окрашивающийся материал - хроматин (слово это в переводе и означает - «окрашенный материал»).

Хроматин представляет собой деспирализованную форму хромосом . Перед клеточным делением хромосомы имеют вид длинных тонких нитей. В хромосомах находится ДНК - генетический материал. ДНК регулирует жизнедеятельность клетки и обладает способностью к репликации, т. е. обеспечивает образование новых клеток .

На рисунках представлены обобщенные животная и растительная клетки , какими они видны в световом микроскопе.(В «обобщенной» клетке показаны все типичные структуры, обнаруживаемые в любой клетке.)

Единственные структуры клетки , которые показаны здесь и которые к концу XIX в. еще не были открыты - это лизосомы. На рисунках представлены микрофотографии некоторых животных и растительных клеток.

Живое содержимое клетки , заполняющее пространство между ее ядром и плазматической мембраной, называется цитоплазмой. В цитоплазме содержится множество различных органелл. Органелла - это клеточная структура определенного строения, выполняющая определенную функцию. Единственная структура, имеющаяся в животных клетках и отсутствующая в растительных - это центриоль. Вообще же растительные клетки очень похожи на животные, но в них обнаруживается больше различных структур. В отличие от животных клеток в растительных клетках имеются:

1) относительно жесткая клеточная стенка , покрывающая снаружи плазматическую мембрану; сквозь поры в клеточной стенке проходят тонкие нити, так называемые плазмодесмы, которые связывают цитоплазму соседних клеток в единое целое;
2) хлоропласта , в которых протекает фотосинтез;
3) крупная центральная вакуоль ; в животных клетках имеются лишь небольшие вакуоли, с помощью которых осуществляется, например, .

О том, как пользоваться световым микроскопом читатель узнает в соответствующей статье.

Прокариоты и эукариоты

В предыдущей статье мы уже говорили о двух типах клеток - прокариоти ческих и эукариоти ческих, - различия между которыми носят фундаментальный характер. В прокариотических клетках ДНК свободно лежит в цитоплазме, в зоне, называемой нуклеоидом; это ненастоящее ядро. У эукариотических клеток ДНК находится в ядре, окруженном ядерной оболочной, состоящей из двух мембран. Соединяясь с белком, ДНК образует хромосомы. О различиях между прокариотическими и эукариотическими клетками более подробно говорится в соответствующей статье.

Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0.2 мм.

Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 - 4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.

Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 45 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.

Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы или светосилы объектива. Светосила объектива -интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA. Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, дистиллированную воду), то получится «иммерсионный» объектив с величиной NA, достигающей 1,4, и с соответствующим улучшением разрешения.

Методы световой микроскопии

Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.

Метод светлого поля и его разновидности

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

Метод темного поля и его разновидности

Метод тёмного поля в проходящем свете (Dark-field microscopy) используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции - т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect) , известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

Проведение темнопольного исследования

Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.

Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:
1. Устанавливают свет по Келеру;
2. Заменяют светлопольный конденсор темнопольным;
3. На верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или дистиллированную воду;
4. Поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла;
5. Объектив малого увеличения фокусируют на препарат;
6. С помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок);
7. Поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна.

Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла).

После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц с×частиц размером до 2×10 в -9 степени м. Но форму и точные размеры таких помощью этого метода определить невозможно. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

Метод фазового контраста

Метод фазового контраста и его разновидность - т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:
1. Набора объективов со специальными фазовым пластинками;
2. Конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;
3. Вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.

Настройка фазового контраста заключается в следующем:
1. Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph) ;
2. Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой "0");
3. Настраивают свет по Келеру;
4. Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;
5. Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;
6. Вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный телескоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный телескоп и вновь устанавливают окуляр.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху.

– это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. Можно сказать, что метод интерференционного контраста сходен с методом фазового контраста - они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и применяются во многих случаях именно с этой целью. Главное отличие интерференционной микроскопии от метода фазового контраста – это возможность измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии относятся также методы использования микроинтерферометров.

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен - возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.