Первичные транскрипты, образующиеся при транскрипции прокариотических генов, кодирующих белки, функционируют в качестве мРНК без последующей модификации или процессинга. Действительно, трансляция мРНК часто начинается даже до завершения синтеза 3"-конца транскрипта. Совсем иная ситуация наблюдается для молекул рРНК и тРНК. В этом случае кластеры рРНК-или тРНК-генов или даже перемежающиеся участки этих генов часто транскрибируются с образованием единой цепи РНК. И хотя транскрипция этих генов всегда начинается на определенных промоторах и заканчивается на определенных терминаторах, для образования зрелых функциональных форм должны произойти специфическое надрезание первичных РНК-транскриптов и модификация. Подобные молекулярные события называют общим термином посттранскрипционные модификации или просто процессинг РНК. Механизмы процессинга рРНК и тРНК и ферменты, с помощью которых он осуществляется, наиболее полно изучены у Е. coli, и для иллюстрации особенностей посттранскрипционного процессинга РНК мы используем эту систему. Аналогичные модификации эукариотических РНК; в этом случае помимо процессинга рРНК и тРНК используются более сложные системы созревания транскриптов с образованием мРНК.
а. Группы генов, кодирующих рРНК и тРНК
В геноме Е. coli идентифицированы и картированы семь дискретных транскрипционных единиц, кодирующих рРНК. Каждая транскрипционная единица - это молекула РНК, которая состоит из ~5000 нуклеотидов и содержит по одной копии кодирующих последовательностей для 5S-, 16S- и 23S-pPHK. Транскрипция в этой области осуществляется в направлении 16S -> 23S -> 5S. Помимо этих трех последовательностей, кодирующих рРНК, транскрипты содержат вставки разной длины и одну или более копий тРНК-генов. Спейсеры могут находиться перед последовательностями для рРНК, между ними и после них, а тРНК-гены обычно лежат в пределах вкрапленных или 3"-концевых спейсерных сегментов. Для образования функционально зрелых молекул РНК должен произойти процессинг таких транскриптов. До процессинга или во время него происходит модификация специфических оснований в спейсерах, а также в рРНК- и тРНК-генах.
б. Разрезание рРНК-тРНК-котранскриптов
Начальное расщепление первичных транскриптов на фрагменты, содержащие либо тРНК, либо 16S-, 23S- или 58-рРНК-последовательности, осуществляет эндонуклеаза РНКаза III. Ее мишенями служат короткие дуплексы РНК, образующиеся при внутримолекулярном спаривании оснований в последовательностях, фланкирующих каждый из рРНК-сегментов. Например, комплементарные участки в спейсерных областях, фланкирующих последовательность 16S-pPHK, образуют стебель шпильки, в петле которой находится последовательность 16S-pPHK. Аналогичные шпильки образуют и последовательности 23S- и 5S-pPHK. РНКаза III вносит разрывы в двухцепочечный стебель, в результате образуется цепь РНК, содержащая последовательность той или иной рРНК, фланкированную короткими спейсерными участками с 5"-фосфатным и 3"-гидроксильным концами. Затем лишние нуклеотиды спейсерных последовательностей удаляются, возможно с помощью той же самой РНК-экзонуклеазы, которая катализирует и последние этапы процессинга тРНК. В принципе для того, чтобы произошло ферментативное расщепление, должны быть транскрибированы только те нуклеотидные последовательности, которые образуют шпильки. Однако процессинг происходит лишь после завершения синтеза всего первичного транскрипта, поскольку, по-видимому, для правильной укладки целого РНК-транскрипта, который и распознается эндонуклеазой III, необходимы рибосомные или какие-либо другие белки. Процессинг тРНК-сегментов, выщепляющихся из мультигенных транскриптов, осуществляется так же, как и процессинг тРНК из транскрипционных единиц одиночных генов.
в. Образование зрелых тРНК из более крупных транскриптов
Несмотря на то, что некоторые кодирующие тРНК гены находятся внутри транскрипционных единиц рРНК и экспрессируются совместно с генами рРНК, основная часть тРНК-генов представлена одиночными генами или объединена в кластеры. Одни кластеры содержат множественные повторы одних и тех же генов, другие - различные и неродственные тРНК-гены. В некоторых случаях каждый кластер транскрибируется как одна большая молекула РНК, которая подвергается процессингу с последовательным выщеплением зрелых тРНК-фрагментов. Для образования зрелой функциональной тРНК, по-видимому, должны произойти специфическая модификация оснований и присоединение одного, двух или всех трех нуклеотидов 3"-ССА-конца.
Независимо от того, содержит ли первичный транскрипт одну или более тРНК-последовательностей или эти последовательности внедрены в спейсерные участки рРНК, 5"-концы всех тРНК образуются при участии одной эндонуклеазы, называемой РНКазой Р. По-видимому, РНКаза Р узнает характерную свернутую структуру тРНК в полинуклеотиде-предшественнике и отщепляет лидерную или спейсерную последовательности, расположенные перед 5"-концом зрелой последовательности тРНК. 3"-концы тРНК образуются с помощью нескольких активностей. До сих пор неидентифицированная эндонуклеаза расщепляет предшественник в том месте шпильки, где находится 3"-конец зрелой тРНК, а затем другая эндонуклеаза, РНКаза D, завершает образование правильного 3"-конца. В некоторых случаях экзонуклеазное расщепление прекращается точно у 3"-ССА-конца зрелой тРНК, а в других случаях под действием экзонуклеазы образуется конец, служащий затравкой, к которому тРНК-нуклеотидилтрансфераза добавляет один или более инвариантных концевых нуклеотидов.
Отличительной особенностью РНКазы Р является то, что сайт расщепления для нее формируется в результате правильной укладки молекулы тРНК. Изменения в нуклеотидной последовательности, не приводящие к нарушению этой укладки, не сказываются и на процессинге 5"-конца. Другим необычным свойством РНКазы Р является то, что она состоит из белка и РНК. Эта РНК имеет специфическую последовательность из 377 нуклеотидов и сама транскрибируется РНК-полимеразой с гена чуть большего размера и затем подвергается процессингу до размера зрелой молекулы. Удивительной особенностью этой РНК оказалось то, что она одна может катализировать такую же эндонуклеазную реакцию, что и целый рибонуклеопротеин; белок же не обладает самостоятельной эндонуклеазной активностью. Таким образом, эндонуклеазная активность может быть присуща самой РНК, а белок, по-видимому, необходим для сохранения структуры РНК в максимально активной конфигурации.
Зрелые тРНК не только имеют характерную конформацию, но и содержат модифицированные нуклеотиды. Многие из таких модификаций оказываются существенными для выполнения некоторых физиологических функций тРНК. Сегодня охарактеризованы лишь немногие из целой армии ферментов, катализирующих огромное количество реакций модификации. Однако ясно, что модификации происходят в основном на стадии РНК-предшественника и в полностью процессированной тРНК. Такие модифицирующие ферменты представляют особый интерес благодаря своей необычной специфичности в отношении определенных последовательностей: например, только отдельные урациловые остатки превращаются в тиоурацил, метилируются до тимина или восстанавливаются до дигидроурацила. Еще более загадочным представляется образование псевдоуридилата при модификации обычной связи между урацилом и рибозой.
Синтез РНК (транскрипция РНК).
Структура РНК.
Организация генетического материала у эукариот.
Способ записи генетической информации
Организация генетического материала. Функциональные отделы генома.
Общие сведения об экспрессии генов.
1. Общие сведения об экспрессии генов
Как известно, в ДНК содержится определенная генетическая информация:
О структуре всех белков и РНК организма, а также о порядке реализации этой информации в разных клетках в процессе онтогенеза и при различных функциональных состояниях.
Поскольку во всех соматических клетках организма - один и тот же набор из 46 хромосом, - то, несмотря сильные отличия между клетками, все они содержат в своих ДНК одну и ту же генетическую информацию. (Некоторое исключение составляют лимфоциты, в процессе формирования которых происходит перестройка генов иммуноглобулинов.)
В процессе репликации ДНК генетическая информация воспроизводится целиком, чтобы затем передаваться дочерним клеткам. Но, кроме того, эта информация экспрессируется (реализуется) в клетке, обуславливая все проявления ее жизнедеятельности. Однако экспрессии подвергается не вся имеющаяся в ядре генетическая информация, а лишь какая-то ее часть.
Экспрессия информации о структуре определенного белка включает 2 основных этапа:
а) Первый из них - транскрипция: образование в клеточном ядре на соответствующем гене (локализующемся в одной из хромосом) специального посредника - матричной РНК (мРНК).
Смысл этого процесса - переписывание информации о структуре белка с огромного неподвижного носителя (ДНК в составе хромосомы) на небольшой подвижный носитель -мРНК. Примерно так же обстоит дело, когда с жесткого диска компьютера, содержащего тысячи файлов, переписывают один из них на дискету. Следовательно, мРНК, считанные с разных генов, должны отличаться друг от друга - как отличаются друг от друга сами гены. Другое важное обстоятельство: непосредственный продукт транскрипции гена правильней называть предшественником мРНК (пре- мРНК). Дело в том, что новообразованная мРНК подвергается тут же (в ядре) созреванию, или процессингу. При этом она претерпевает существенную модификацию. И лишь после того зрелая мРНК поступает из ядра в цитоплазму.
б) Второй из основных этапов экспрессии гена трансляция: синтез белка на рибосомах по программе, диктуемой мРНК. Суть этой программы - определение очередности, в которой аминокислоты должны включаться в строящуюся пептидную цепь. Причем в процессе участвуют не свободные, а активированные аминокислоты: каждая из них связана с т. н. транспортной РНК (тРНК), т. е. находится в виде аминоацил- тРНК (аа- тРНК). Для каждой из 20 аминокислот имеется своя специфическая форма тРНК, а чаще даже не одна, а несколько форм.
Рибосомы же играют в трансляции роль молекулярных машин, обеспечивающих правильное взаимодействие участников. В состав рибосомы входят четыре молекулы т. и. рибосомной РНК (рРНК) - по одной молекуле каждого из 4 х видов рРНК. Объединяясь с рибосомными белками, они образуют две субъединицы рибосомы и выполняют в них структурную, а также, возможно, каталитическую функции. Таким образом, в трансляции участвуют PНK трех классов - мРНК, тРНК и рРНК.
2. Организация генетического материала. Функциональные отделы генома
Гены и их структура
Собственно информация о структуре белков и РНК записана в участках ДНК, называемых генами и цистронами.
Ген - это участок ДНК, кодирующий один белок.
Цистрон же участок ДНК, кодирующий одну полипептидную цепь.
У животных и человека цистроны нередко располагаются в разных хромосомах и обычно тоже называются генами. Кроме генов всех белков организма, в хромосомах имеются также гены РНК - четырех видов рибосомных РНК и нескольких десятков транспортных РНК.
Общая совокупность генов, определяющих наследственную информацию организма, называется геномом .
Почти все гены эукариот (в отличие от генов прокариот) имеют характерную особенность: содержат не только кодирующие участки -экзоны , но и некодирующие -интроны . Экзоны и интроны перемежаются друг с другом, что придает гену как бы «разорванную» структуру.
Число интронов в гене варьирует от 2 до нескольких десятков; в гене миозина их около 50. Порой на интроны приходится до 90 % общей длины гена.
Прочие отделы ДНК
Между генами также находятся некодирующие последовательности - спейсеры . Несмотря на общее название, функциональная роль их может быть обсалютно различной.
а) Многие спейсерные участки, видимо, выполняют структурную роль:
Участвуют в правильной укладке нуклеосомной цепи в высшие структуры хроматина,
В прикреплении хромосом к аппарату центриолей и т. д.
б) Другие некодирующие участки ДНК служат специфическими локусами связывания определенных белков:
Функционирующих на ДНК ферментов,
Белков, выполняющих регуляторную функцию.
При этом участки связывания РНК-полимеразы (фермента, синтезирующего РНК на ДНК) называются промоторами . Они либо вплотную примыкают к началу гена (или группы генов), либо отделены от гена какими-либо другими функциональными локусами.
в) У эукариот (включая человека) регуляцию «прочтения» генов осуществляют не только белки-репрессоры, но и белки-активаторы - т. н. транскрипционные факторы.
К последним относятся уже упоминавшиеся общие факторы транскрипции, необходимые для связывания РНК полимеразы с промотором. Эти факторы имеются во всех клетках и необходимы для «прочтения» любого функционирующего гена.
Другие транскрипционные факторы повышают активность только определенных генов, и локусы ДНК, связывающие такие факторы, называются энхансерами .
г) Наконец, в ДНК могут содержаться короткие локусы, служащие сигналами об окончании (терминации ) транскрипции ДНК.
Терминирующие участки, располагающиеся после генов, называются терминаторами .
3. Способ записи генетической информации
Функциональная роль цепей ДНК
Две цепи ДНК в области гена принципиально различаются по своей функциональной роли: одна из них является кодирующей или смысловой , вторая - матричной .
Это значит, что в процессе «считывания» гена (транскрипции, или синтеза пре-мРНК) в качестве матрицы выступает только одна - матричная - цепь ДНК. Продукт же этого процесса - пре- мРНК по последовательности нуклеотидов совпадает с кодирующей цепью ДНК (с заменой тиминовых оснований на урациловые).
Таким образом, получается, что с помощью матричной цени ДНК при транскрипции воспроизводится в структуре РНК генетическая информации кодирующей цепи ДНК.
На рисунках ген принято изображать так, чтобы кодирующая цепь была сверху; тогда, в соответствии с общим правилом изображения ДНК, 5"-конец кодирующей цепи должен располагаться слева.
Информация на кодирующей цепи записана в направлении 5´→3´; следовательно, промотор находится со стороны 5"-конца кодирующей цепи гена. И этот же конец принято считать 5"-концом всего гена (хотя у его матричной цепи здесь находится 3‘- конец).
Основные свойства генетического кода
Единицей информации в кодирующей цепи ДНК является триплет - последовательность из трех нуклеотидов.
4 вида нуклеотидов (встречающиеся в ДНК) могут образовывать 64 вида триплетов. Из них 61 триплет является смысловым, т. е. кодирует ту или иную из 20 аминокислот, а 3 триплета являются «бессмысленными».
Как видим, на одну аминокислоту приходится в среднем несколько смысловых триплетов (в реальности от 1 до 6). По этой причине генетический код называют вырожденным . Не будь он таким, случайные точечные мутации (замены в ДНК одних нуклеотидов на другие) с очень высокой частотой приводили бы к появлению «бессмысленных» триплетов.
В то же время код специфичен : каждому из смысловых триплетов соответствует только одна аминокислота.
Сама же информация о белке состоит в том, что в полном гене (исключая интроны) линейная последовательность триплетов кодирует аналогичную линейную последовательность аминокислот в первичной структуре данного белка (в направлении от аминного к карбоксильному концу пептидной цепи).
Этого оказывается вполне достаточно, поскольку первичная структура белка определяет пространственную конфигурацию белковой молекулы, а также ее физико-химические и биологические свойства.
Линейное соответствие между последовательностью триплетов в экзонах гена и аминокислот в пептидной цепи обозначается как коллинеарность генетического кода.
Итак, генетический код является триплетным. специфическим, вырожденным, коллинеарным и непрерывным. К этому списку обычно добавляют универсальность : у всех видов организмов смысл любого триплета один и тот же.
Говоря о коде, до сих пор мы имели в виду смысловую цепь ДНК. Но такова же, с учетом замены тимина (Т) на урацил (У), последовательность нуклеотидов в пре-мРНК.
Триплеты мРНК, соответствующие триплетам ДНК, называются кодонами . Действительно, именно они непосредственно:
Определяют порядок включения аминокислот в пептидную цепь, синтезируемую на рибосоме.
Кодоны одной аминокислоты различаются лишь последним (третьим) нуклеотидом.
У сходных по строению аминокислот кодоны также сходны между собой: совпадают по двум нуклеотидам или по одному, но центральному, нуклеотиду.
4. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У ЭУКАРИОТ
Гены ряда белков и РНК
Одна из отличительных черт многих генов эукариот - наличие в их составе некодирующих участков - интронов.
Другая особенность состоит в том, что наряду с уникальными генами (представленными в гаплоидном геноме единичным числом копий) встречаются многократно повторяющиеся гены.
Чтобы проиллюстрировать эти две особенности, рассмотрим некоторые конкретные гены:
Гены гистонов
Гистоны - основные (по кислотно-щелочным свойствам) белки, участвующие в формировании нуклеосомной структуры хроматина. Каждый из пяти видов этих белков (HI, Н2А, Н2В, НЗ и Н4) кодируется соответствующим геном.
Гены рибосомных РНК
В состав рибосом входят рРНК четырех видов. Данные РНК различаются по константе седиментации.
На функционирование генов оказывают влияние очень многие белки.
Общие факторы транскрипции
Общие факторы транскрипции – это такие транскрипционные факторы, которые необходимы для связывания РНК-полимеразы с промотором, причем и сами тоже взаимодействуют с промотором.
Белок р53 как транскрипционный фактор
Среди большого числа уже открытых транскрипционных факторов наиболее известен, пожалуй, белок р53. Это объясняется тем, что он контролирует исключительно важные клеточные процессы и, благодаря этому, вовлечен в большое количество всевозможных регуляторных цепей.
Функциональная роль.
Белок р53 (или его ген) активируется в ответ на разнообразные повреждения клеточной структуры:
Нерепарированные разрывы и другие повреждения ДНК,
Нарушение расхождения хромосом в митозе,
Разрушение микротрубочек и т. д.
В итоге через посредничество белка р53 клетка в ответ на повреждения своей структуры
Либо задерживается на той или иной стадии митотического цикла и исправляет эти повреждения;
Либо (при невозможности исправлений) вообще прекращает деления и вступает в процесс клеточного старения;
Либо (при потенциальной опасности поврежденной клетки для ее окружения) осуществляет апоптоз, т. е., попросту говоря, самоубийство.
В частности, апоптозу, помимо прочих, подвергаются и клетки, в которых произошла опухолевая трансформация. В этой связи понятно, почему одновременно тормозится ангиогенез: это еще один способ ограничения опухолевого роста.
Поэтому белок р53 - один из наиболее важных опухолевых супрессоров. В большинстве же развивающихся опухолей функции белка р53 оказываются в том или ином отношении нарушены.
5. СТРУКТУРА РНК
Все транскрипционные факторы, как и сама транскрипция, призваны обеспечить только одно - образование с нужной скоростью РНК на тех или иных участках хромосом.
Общий план строения РНК
Как и ДНК, РНК представляют собой линейные (т. е. неразветвленные) полинуклеотиды с тем же принципом организации:
Состоят из четырех видов нуклеотидов, каждое из которых включает азотистое основание, пентозу и фосфатный остаток;
Нуклеотиды связаны в цепь с помощью 5´,3´-фосфоди- эфирных связей;
Полинуклеотидные цепи полярны, т. е. имеют различимые 5"- и 3"-концы.
Но имеются и отличия от ДНК. Главное из них - то, что молекулы РНК (кроме РНК некоторых вирусов) являются не двух-, а одноцепочечными. Причиной служат следующие три особенности первичной структуры.
а) Во-первых, пентоза в РНК это не дезоксирибоза, а ри боза, которая содержит дополнительную гидроксигруппу. Последняя делает двухцепочечную структуру менее компактной.
б) Во вторых, среди четырех главных, или мажорных, азотистых основании вместо тимина содержится урацил, отличающнйся от тимина лишь отсутствием метильной группы в 5-м положении.
6. СИНТЕЗ РНК (ТРАНСКРИПЦИЯ ДНК)
Общая характеристика транскрипции
В отличие от репликации ДНК, транскрипция ДНК происходит практически во всех ядросодержащих клетках - как делящихся, так и неделящихся.
Причем в делящихся клетках она совершается в любой момент митотического цикла, кроме периода репликации (у эукариот) и собственно деления.
Более того, транскрипция какого либо участка ДНК может совершаться не только почти в любой момент цикла, но и многократно - сколь угодное число раз. С другой стороны, набор транскрибируемых в клетке участков под действием тех или иных факторов нередко меняется.
Ферментативное обеспечение процесса осуществляется РНК-полимеразой. У эукариот три вида этого фермента:
РНК-полимераза I - для синтеза пре-рРНК.
РНК-полимераза II - для синтеза пре-мРНК и
РНК-полимераза III - для синтеза пре-тРНК
Фермент ползет вдоль ДНК и катализирует поочередное включение в растущую цепь рибонуклеотидов, комплементарных нуклеотидам матричной цепи ДНК.
Еще одно сходство с синтезом ДНК состоит в направлении роста строящейся цепи - 5´→3´. Это значит, что у этой цепи очередные нуклеотиды присоединяются к З"-концу.
Как при всех матричных синтезах, строящаяся цепь антипараллельна матричной цепи ДНК. Следовательно, последняя транскрибируется ферментом в направлении 3´→5´.
Но имеются и принципиальные отличия от синтеза ДНК.
а) Асимметричность процесса: в качестве матрицы, как мы знаем, используется лишь одна цепь ДНК. Не совсем ясно, как ферментная система осуществляет правильный выбор нужной цепи. Видимо, ключевую роль тут играют какие-то последовательности нуклеотидов на одной из цепей, узнаваемые системой.
б) Консервативность процесса: молекула ДНК по окончании синтеза РНК возвращается в исходное состояние. При синтезе же ДНК молекулы наполовину обновляются, что делает репликацию полуконсервативной.
в) Наконец, синтез РНК не требует для своего начала никакой затравки, тогда как при репликации ДНК необходима РНК- затравка.
Механизм транскрипции
Инициация транскрипции
Первый и, пожалуй, важнейший этап транскрипции - это ее инициация: связывание РНК- полимеразы с промотором и образование первой межнуклеотидной связи.
О связывании РНК-полимеразы мы говорили уже не раз, поэтому сейчас лишь напомним основные моменты (с добавлением некоторых сведений).
У эукариот всегда требуется предварительное связывание с промотором целой совокупности белков общих факторов транскрипции, с образованием комплекса. Связавшись с промотором, РНК- полимераза вызывает локальную денатурацию ДНК, т. е. разделение цепей ДНК на протяжении примерно 1,5 витка ДНК. Как говорят, образуется транскрипционный «глазок». Благодаря этому нуклеотиды матричной цепи ДНК в области «глазка» становятся доступными для спаривания с рНТФ (рибонуклеозидтрифосфат).
Первым в строящуюся цепь РНК всегда включается пуриновый нуклеотид - АТФ или ГТФ, причем все три его фосфатных остатка сохраняются.
Затем образуется первая 5",3"-фосфатная связь со вторым нуклеотидом.
Элонгация транскрипции
Следующий за инициацией этап - элонгация: постепенное удлинение растущей цепи пре- РНК до окончательного размера.
Это происходит по мере продвижения РНК-полимеразы по ДНК. Соответственно, перемещается и транскрипционный «глазок», т. е. участок локального расплетения ДНК. На транскрибированной же части ДНК двухцепочечная спиральная структура восстанавливается сразу после ухода РНК- полимеразы.
Примерная скорость движения фермента и синтеза РНК - 30 нуклеотидов в секунду.
Терминация транскрипции
Последний этап терминация, или окончание транскрипции.
Сигналом для этого служат специальные ГЦ-богатые участки в конце генов. Поскольку сила взаимодействия пар ГЦ довольно велика, локальная денатурация таких участков в ДНК происходит трудней. Это замедляет продвижение РНК -полимеразы и может служить для нее сигналом к прекращению транскрипции.
Но еще до окончания процесса в конце новосинтезированной РНК тоже успевает появиться ГЦ богатый участок. Благодаря взаимодействию между своими нуклеотидами, он образует «шпильку».
Т. е. взаимодействия с нуклеотидами матричной цепи ДНК заменяются на «внутришпилечные» взаимодействия. Это облегчает отсоединение РНК от ДНК.
7. СОЗРЕВАНИЕ (ПРОЦЕССИНГ) РНК
Практически все процессы созревания РНК могут быть подразделены на три типа:
Удаление одних,
Присоединение других и
Модификация тех же или третьих нуклеотидов.
Удаление «лишних» последовательностей
Удаление «лишних» нуклеотидов осуществляется специальными нуклеазами. Экзонуклеазы последовательно отщепляют с определенного конца цепи (3´ или 5´) по одному нуклеотиду. А эндонуклеазы разрезают цепь где-то в средних участках, приводя к ее фрагментации.
Механизм, сплайсинга
Один из ключевых моментов рассматриваемого механизма обеспечение точности разрезания цепи пре-РНК: ошибка даже на один нуклеотид приведет к «сдвигу рамки», что изменит смысл всех кодонов мРНК или антикодона тРНК.
Точность достигается благодаря двум обстоятельствам:
Во-первых, в начале и в конце каждого интрона имеются определенные последовательности нуклеотидов: так, интроны всегда начинаются с Г-У, а кончаются дуплетом А-Г.
Во-вторых, для узнавания этих последовательностей используются специальные РНК т. н. малые ядерные РНК (мяРНК). Последние связаны с ферментами, катализирующими сплайсинг. Такие рибонуклеопротеидные комплексы называются сплайосомами.
Сплайсинг начинается со взаимодействия двух мяРНК с началом и концом интрона. Это дает «ориентацию» для эндонуклеазы: последняя действует на границах двух- и одноцепочечных участков.
Первый разрыв пре-РНК происходит в области 5´ конца интрона - это место нахождения левого края левой мяРНК. При этом 5" конец интрона связывается с одним из нуклеотидов в средней части того же интрона, что приводит к образованию кольцевой структуры.
Присоединение и модификация нуклеотидов
Итак, в процессе созревания пре-РНК последняя теряет значительную часть нуклеотидов. Но происходит также и нетранскрипционное присоединение отдельных нуклеотидов.
В случае пре-мРНК со стороны 5"-конца присоединяется (с помощью нетипичной для полинуклеотидов пирофосфатной связи) 7-метилгуаниловый нуклеотид - компонент «колпачка». А со стороны З"-конца понуклеотидно наращивается поли(А)-фрагмент примерно из 200 нуклеотидов. Для этого используются специальные ферменты; в частности, для образования поли(А) - фрагмента полиаденилатполимераза.
В случае же пре-тРНК с З"-конца по очереди присоединяются три нуклеотида - Ц, Ц и А, образующие акцепторную ветвь.
Созревание мРНК называется процессингом. Биологическое значение процессинга в эукариотической клетке заключается в возможности получения различных комбинаций экзонов гена, а значит, получения большего разнообразия белков, кодируемых одной нуклеотидной последовательностью ДНК.
Кроме того модификация 3’- и 5’-концов мРНК служит для регуляции ее экспорта из ядра, поддержания стабильности в цитоплазме и для улучшения взаимодействия с рибосомами.
Еще до завершения транскрипции происходит полиадени- лирование З’-конца (разд. 6.3). К 5"-концу мРНК посредством трифосфатного моста присоединяется 7-метилгуанозин, соединяющийся в необычной позиции 5"^5", и происходит метилирование рибоз двух первых нуклеотидов. Этот процесс называется кэпированием.
Процесс вырезания определенных нуклеотидных последовательностей из молекул РНК и соединения последовательностей, сохраняющихся в «зрелой» молекуле, в ходе процессинга РНК, называется сплайсингом. В ходе сплайсинга из мРНК участки, не кодирующие белок (интроны), удаляются, а экзоны - участки, кодирующие аминокислотную последовательность, соединяются друг с другом, и незрелая пре-мРНК превращается в зрелую мРНК, с которой синтезируются (транслируются) белки клетки.
Для сплайсинга необходимо наличие специальных 3"- и 5"- последовательностей. Сплайсинг катализируется состоящим из РНК и белков большим комплексом, который называется сплайсосомой. Сплайсосома включает пять малых ядерных ри- бонуклеопротеидов (мяРНП) - и1, и2, и4, и5 и иб. РНК, входящая в состав мяРНП, взаимодействует с интроном и, возможно, участвует в катализе. Она принимает участие в сплайсинге интронов, содержащих в 5" сайте ГУ, и АГ в 3" сплайсинг-сайте.
Иногда мРНК в процессе созревания могут подвергаться альтернативному сплайсингу, который заключается в том, что имеющиеся в составе пре-мРНК интроны вырезаются в разных альтернативных комбинациях, при которых вырезаются и некоторые экзоны. Некоторые из продуктов альтернативного сплайсинга пре-мРНК нефункциональны, как например, при определении пола у плодовой мушки дрозофилы, однако часто в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК одного гена образуются многочисленные мРНК и их белковые продукты.
В настоящее время известно, что у человека 94 % генов подвержено альтернативному сплайсингу (остальные б % генов не содержат интронов). Альтернативный сплайсинг у многоклеточных эукариот является ключевым механизмом увеличения разнообразия белков, не создавая избыточных копий гена, а также позволяет осуществлять тканеспецифическую и стадиеспецифическую регуляцию экспрессии (проявления) генов.
Сразу после синтеза первичные транскрипты РНК по разным причинам еще не имеют активности, являются "незрелыми" и в дальнейшем претерпевают ряд изменений, которые называются процессинг . У эукариот процессингу подвергаются все виды пре-РНК, у прокариот – только предшественники рРНК и тРНК.
Процессинг предшественника матричной РНК
При транскрипции участков ДНК, несущих информацию о белках, образуются гетерогенные ядерные РНК, по размеру намного превосходящие мРНК. Дело в том, что из-за мозаичной структуры генов эти гетерогенные РНК включают в себя информативные (экзоны ) и неинформативные (интроны ) участки.
1. Сплайсинг (англ. splice – склеивать встык) – особый процесс, в котором при участии малых ядерных РНК происходит удаление интронов и сохранение экзонов.
Последовательность событий сплайсинга
2. Кэпирование (англ. cap – шапка) – происходит еще во время транскрипции. Процесс состоит в присоединении к 5"-трифосфату концевого нуклеотида пре-мРНК 5"-углерода N 7 -метил-гуанозина.
"Кэп" необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 5"-конца, а также для связывания мРНК с рибосомой и для начала трансляции.
3. Полиаденилирование – при помощи полиаденилат-полимеразы с использованием молекул АТФ происходит присоединение к 3"-концу РНК от 100 до 200 адениловых нуклеотидов, формирующих полиадениловый фрагмент – поли(А)-хвост. Поли(А)-хвост необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 3"-конца.
Схематичное представление матричной РНК после процессинга
Процессинг предшественника рибосомальной РНК
Предшественники рРНК являются более крупными молекулами по сравнению со зрелыми рРНК. Их созревание сводится к разрезанию прерибосомной РНК на более мелкие формы, которые уже непосредственно участвуют в формировании рибосомы. У эукариот существуют четыре типа рРНК – 5S-, 5,8S-, 18S- и 28S-рРНК . При этом 5S-рРНК синтезируется отдельно, а большая прерибосомная 45S-РНК расщепляется специфичными нуклеазами с образованием 5,8S-рРНК, 18S-рРНК и 28S-рРНК.
У прокариот молекулы рибосомальной РНК совсем иные по своим свойствам (5S-, 16S-, 23S-рРНК), что является основой изобретения и использования ряда антибиотиков в медицине.
Процессинг предшественника транспортной РНК
1. Модификация нуклеотидов в молекуле путем дезаминирования, метилирования, восстановления.
Например, образование псевдоуридина и дигидроуридина.
Строение модифицированных уридиловых нуклеотидов
2. Формирование антикодоновой петли происходит путем сплайсинга
Процессинг - это созревание синтезированной на ДНК преРНК и преобразование её в зрелую РНК. Проходит в ядре клетки у эукариот.
Составные части процессинга
- Удаление нуклеотидов. Результат: значительное уменшение длины и массы исходной РНК.
- Присоединение нуклеотидов. Результат: незначительное увеличение длины и массы исходной РНК.
- Модификация (видоизменение) нуклеотидов. Результат: появление в составе РНК редких "экзотических" минорных ("меньших") нуклеотидов.
Удаление нуклеотидов
1. Отщепление отдельных нуклеотидов по одному с концов цепи РНК. Осуществляется ферментами экзонуклеазами . Обычно преРНК начинается на 5"-конце АТФ или ГТФ, а на 3"-конце заканчивается участками ГЦ. Они нужны только для самой транскрипции, но не нужны для работы РНК, поэтому и отщепляются.
2. Отрезание фрагментов РНК, состоящих из нескольких нуклеоидов. Осуществляется ферментами эндонуклеазами . Таким способом с концов преРНК удаляются спейсерные последовательности нуклеотидов.
3. Разрезание преРНК на отдельные индивидуальные молекулы РНК. Осуществляется ферментами эндонуклеазами. Таким способом получаются рибосомальные РНК (рРНК) и гистоновые (мРНК).
4. Сплайсинг . Это вырезание срединных участков (интронных последовательностей) из преРНК и затем её сшивание . Вырезание осуществляется ферментами эндонуклеазами, а сшивание - лигазами . В результате получается мРНК, состоящая только из экзонных последовательностей нуклеотидов. Все пре-мРНК подвергаются сплайсингу, кроме гистоновых.
В результате удаления нуклеотидов в мРНК может, например, вместо 9200 нуклеотидов остаться всего 1200.
В среднем после процессинга в зрелой мРНК остаётся только 13% от длины пре-мРНК, а 87% теряется.
Присоединение нуклеотидов
К пре-мРНК с начального 5"-конца присоединяется с помощью нетипичной пирофосфатной связи модифицированный 7-метилгуаниловый нуклеотид, это компонент "колпачка" ("шапочки") мРНК. Этот колпачок создаётся ещё на начальном этапе синтеза РНК, для того чтобы защитить нарождающуюся РНК от нападок ферментов-экзонуклеаз, отщепляющих концевые нуклеотиды от РНК.
После завершения синтеза пре-мРНК к её конечному участку со стороны 3"-конца ферментом полиаденилатполимеразой последовательно приращиваются адениловые нуклеотиды, так что получается полиадениловый "хвост" из примерно 200-250 А-нуклеотидов. Мишенью для этого процесса служат последовательности ААУААА и ГГУУУГУУГГУУ в конце преРНК. В результате у преРНК отрезается её собственный хвостик и заменяется на полиА-хвост.
Видео: Снабжение преРНК шапочкой и хвостиком
У пре-тРНК хвост на её 3"-конце создаётся последовательным присоединением трёх нуклеотидов: Ц, Ц и А. Они образуют акцепторную ветвь транспортной РНК.
Модификация нуклеотидов
Важно отметить, что модифицированные минорные нуклеотиды появляются в созревающей РНК именнов в результате процессинга, а не встраиваются в РНК в процессе её синтеза на ДНК.
В нуклеотидах колпачка пре-мРНК происходит метилирование рибозы.
В пре-рРНК метилируются рибозные остатки выборочно по всей длине цепи, с частотой примерно 1%, т.е. 1 нуклеотид из 100.
В пре-тРНК модификация происходит наиболее разнообразно. Например, если уридин восстанавливается, то получается дигидроуридин, если изомеризуется, то получается псевдоуридин, если метилируется, то получается метилуридин, Аденозин может дезаминироваться, превращаясь в инозин, а если затем метилируется, то получается метилинозин. Происходят и другие модификации нуклеотидов.
Видео: Подробно о процессинге
Итог процессинга
Исходные преРНК укорачиваются и модифицируются . В ядре клетки появляются зрелые РНК разных видов: рРНК (28S, 18S, 5,8S, 5S), тРНК (по 1-3 вида для каждой из 20 аминокислот), мРНК (тысячи вариантов в зависимости от количества экспрессированных в данной клетке генов). Здесь же в ядре рРНК связываются с рибосомными белками и формируют большие и малые субъединицы рибосом. Они покидают ядро и выходят в цитоплазму. А мРНК связываются с транспортными белками и в таком виде выходят из ядра в цитоплазму.